Thesis Number |
level |
Language |
Year |
Bilim Dalı |
|
Yüksek Lisans |
Türkçe |
2018 |
Biyokimya Bilim Dalı |
Asetilkolinesteraz (AChE; EC 3.1.1.7), bir nörotransmitter olan asetil kolinin, kolin ve asetatata dönüşümünü katalizleyen bir hidrolazdır ve yaşam için büyük bir önem taşır. Pestisitlerde kullanılan etken maddeler kuvvetli AChE inhibitörleridir ve bu maddelerin eser miktarları bile canlılar için tehlike oluşturabilir. AChE inhibisyonu ölçülmesi, pestisitlerin tarımda çalışanlara ve çevreye verdiği zararı belirlemek için önemli bir biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Hızlı ve hassas AChE ölçümü için biyosensör tasarımının ilk ve en kritik basamağını, AChE enziminin bir elektrot yüzeyine immobilizasyonu oluşturmaktadır. Bu çalışmada AChE enzimini immobilize etmek için hızlı ve tek basamaklı bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Tasarlanan sistemde pirolün ve tiyol-en bileşenlerinin eş zamanlı polimerizasyonu ile elektriksel olarak iletken ve fonksiyonel gruplara sahip polimerik yüzeylerin elde edilmesi planlanmıştır. İletken tiyol-en kürlenebilen için öncelikle pentaeritritoltetrakis (3merkaptopropiyonat) (4SH), 1,3,5-Trialil-1,3,5-triazin-4,6 (1H,3H,5H)-trionTTT) ve alil glisidil eter (AGE) ve pirol belirli oranlarda karıştırılıp fotobaşlatıcı ve UV ışığı eşliğinde polimerleştirilmesiyle elde edilen filmlere epoksi grupları üzerinden AChE immobilize edildi. Ayrıca ikinci bir yol olarak, bu reaksiyona girmemiş serbest epoksi grupları polietilenimin (PEI) ile modifiye edilip ardından glutaraldehit ile enzim immobilizasyonu gerçekleştirildi. İmmobilizasyon öncesi ve sonrası filmlerin Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) tekniği ile fonksiyonel grupları incelendi.
İmmobilizasyon ile enzimin optimum sıcaklığı her iki polimer için serbest enzime göre 30°C'den 50°C'ye çıkarken, optimum pH değeri 8.0 den, 8.5'a çıkmıştır. Serbest enzim için Michaelis-Menten sabiti (Km) ve Vmaks değerleri sırasıyla 1.25 mM, 1.53 mM/dakika bulunurken, epoksi grupları taşıyan polimere immobilize edilen enzim için 0.182 mM, 0.416 mM/dakika, PEI modifiye polimer için 0.5 mM, 0.018 mM/dakika bulunmuştur. İmmobilize edilen enzim üzerine Mn+2,Mg+2,Cu+2,Zn+2,Ca+2 metallerinin etkisi araştırıldığında en fazla inhibisyona Cu+2'ın sebep olduğu anlaşılmıştır. 10 deneme sonrasında polimerik desteklere immobilize edilen enzim ilk aktivitesininin %51'ini korumuştur. 60 günün sonunda serbest enzim aktivitesini tamamen kaybederken, immobilize enzim aktivitesinin %29.1'ini kaybetmiştir. Sonuçlarımıza göre her iki polimer üzerine immobilize edilen enzimin kararlılığı ve dayanıklılığı arttığı görülmektedir. Ürettiğimiz bu polimerler sağlam, kullanışlı ve düşük maliyetli bir AChE biyosensör tasarımında kullanılabilir.